Флуоресцентна микроскопия: принципи на метода

Абсорбция и повторно излъчване на светлина допълнителни неорганични и органични течности е резултат от фосфоресценцията или флуоресценцията. Разликата между явленията се състои в продължителността на интервала между абсорбцията на светлина и излъчването на потока. С флуоресценцията тези процеси протичат почти едновременно и с фосфоресценция - с известно закъснение.

Исторически контекст

През 1852 г. британският учен Stokes за първи път описва флуоресценцията. Той въведе нов термин в резултат на експерименти с флуорит, който излъчва червена светлина под въздействието на ултравиолетовите лъчи. Стоукс отбеляза интересен феномен. Той установи, че дължината на вълната с флуоресцентно лъчение е винаги по-голяма от тази на възбуждащия светлинен поток.

За потвърждаване на хипотезата през 19 век бяха проведени много експерименти. Те показаха, че различни проби флуоресцират под действието на ултравиолетовите лъчи. Сред материали, наред с други неща, са кристали, смоли, минерали, хлорофил, сурови лекарства, неорганични съединения, витамини, масла. Директното нанасяне на бои за извършване на биологични анализи започва едва през 1930 г.

Флуоресцентна микроскопия: описание

Някои от материалите, използвани в изследванията от първата половина на 20-ти век, имат висока специфика. Благодарение на показателите, които не могат да бъдат постигнати чрез методите за контраст, флуоресцентен микроскопски метод се превърна във важен инструмент както в биомедицинските, така и в биологичните изследвания. Получените резултати нямат никакво значение за науката за материалите.

Какви са предимствата на флуоресцентната микроскопия?? С помощта на нови материали стана възможно да се изолират силно специфични клетки и субмикроскопични компоненти. Флуоресцентен микроскоп може да открива отделни молекули. Разнообразието от багрила позволява идентифицирането на няколко елемента едновременно. Въпреки ограничената пространствена разделителна способност на оборудването чрез дифракционната граница, която от своя страна зависи от специфичните свойства на пробата, откриването на молекули под това ниво също е напълно възможно. Различните проби след облъчването показват автофлуоресценция. Това явление е широко използвано в петрологията, ботаниката, производството на полупроводници.

Удобства

Проучването на животинските тъкани или патогенните микроорганизми често се усложнява от твърде слаба или много силна неспецифична автофлуоресценция. Значението в изследванията обаче е въвеждането в материала на компоненти, възбудени при определена дължина на вълната и излъчващи светлинен поток с необходимия интензитет. Флуорохромите действат като оцветители, способни да се прикрепят към структури (невидими или видими). В същото време те са силно селективни по отношение на целите и квантовата доходност.

Флуоресцентна микроскопия широко се използва с появата на естествени и синтетични багрила. Те имат определени профили на интензивност на емисия и възбуждане и са насочени към конкретни биологични цели.

Идентификация на отделните молекули

Често при идеални условия може да се регистрира блясъкът на отделен елемент. За да се направи това, наред с други неща, е необходимо да се осигури достатъчно нисък шум на детектора и оптичен фон. Молекулата флуоресцеин преди разрушаването, дължаща се на фотооборудване, може да излъчва до 300 хиляди фотона. При 20% от събирането и ефективността на процеса, те могат да бъдат регистрирани в размер на около 60 хиляди.

Флуоресцентна микроскопия, въз основа на лавина фотодиоди или електронен умножение, оставя изследователите да наблюдават поведението на отделните молекули през втората, и в някои случаи дори минути.

сложност

Основният проблем е потискането на шума от оптичния фон. Поради факта, че много от материалите, използвани при проектирането на филтри и лещи, проявяват известна автофлуоресценция, усилията на учените в началните етапи са фокусирани върху производството на компоненти с ниска флуоресценция. Следващите експерименти обаче доведоха до нови изводи. По-специално, беше установено, че флуоресцентна микроскопия, въз основа на пълното вътрешно отражение, позволява да се постигне нисък фон и възбуждащ светлинен поток с висока интензивност.

механизъм

Принципи на флуоресцентната микроскопия, въз основа на цялостното вътрешно отражение, се състои в използването на бързо разпадаща се или неразпространена вълна. Тя възниква на границата на медиите с различни индекси на пречупване. В този случай светлинният лъч минава през призмата. Той има висок индекс на пречупване.

Призмата е прикрепена към воден разтвор или стъкло с нисък параметър. Ако потокът от светлина е насочен към него под ъгъл, който е по-голям от критичния, лъчът напълно се отразява от интерфейса. Това явление, от своя страна, причинява неразпространена вълна. С други думи, се генерира електромагнитно поле, което прониква в средата с по-малък индекс на пречупване на разстояние по-малко от 200 нанометра.

В неразпространена вълна интензивността на светлината ще бъде достатъчно, за да възбуди флуорофорите. Въпреки това, поради изключително ниската си дълбочина, неговият обем ще бъде много малък. В резултат на това се появява фон на ниско ниво.

модификация

Флуоресцентната микроскопия, базирана на пълно вътрешно отражение, може да бъде реализирана с помощта на epi-осветяване. Това изисква лещи с увеличена числена апертура (поне 1,4, но е желателно да достигне 1,45-1,6), както и частично осветено поле на устройството. Последното се постига с помощта на място с малък размер. За по-голяма равномерност се използва тънък пръстен, през който част от потока е блокирана. За да се получи критичен ъгъл, след който се получава пълно отразяване, е необходимо високо ниво на пречупване на средата на потапяне в лещите и покриващото стъкло на микроскопа.