Молекулярно-биологични методи за изследване и тяхното използване

молекулярна биология изследователски методи

Молекулярни биологични методи за изследване. Какво е това?

През 70-те и 80-те години на миналия век учените са успели да дешифрират човешкия геном за първи път. Това събитие даде тласък на развитието на генното инженерство и молекулярната биология. Проучването на свойствата на ДНК и РНК доведе до факта, че сега е възможно да се използват тези нуклеинови киселини, за да се диагностицира болестта, да се изследват гени.

Приготвяне на ДНК и РНК

молекулярна биология диагностични методи изискват наличие на изходен материал: по-често това са нуклеинови киселини. Има няколко начина за изолиране на тези вещества от клетките на живите организми. Всеки от тях има своите предимства и недостатъци и това трябва да се има предвид при избора на метода за изолиране на нуклеинови киселини в чиста форма.

1. Подготовка на ДНК според Мармур. Методът се състои в третиране на сместа от вещества с алкохол, в резултат на което се утаява чиста ДНК. Недостатъкът на този метод е използването на агресивни вещества: фенол и хлороформ.

2. ДНК изолация от Boom. Основното вещество, използвано тук, е гуанидин тиоцианат (GuSCN). Той насърчава валежите дезоксирибонуклеинова киселина върху специализирани субстрати, от които в бъдеще може да се събира чрез специален буфер. Въпреки GuSCN - е инхибитор на TCP, и дори малка част от които получава депозирани в ДНК може да повлияе на хода на полимеразна верижна реакция, което е важно, когато се работи с нуклеинови киселини.

3. Утаяване на примеси. Методът се различава от предишните, тъй като не се утаяват молекулите на самата дезоксирибонуклеинова киселина, а примесите. За да направите това, използвайте йонообменници. Недостатъкът е, че не всички вещества могат да се утаят.

4. Масов скрининг. Този метод се използва в случаите, когато не е необходима точна информация за състава на ДНК молекулата, но е необходимо да се получат някои статистически данни. Това се дължи на факта, че структурата на нуклеиновата киселина може да бъде повредена чрез третиране с детергенти, по-специално с алкали.

Класификация на изследователските методи

Всички молекулярни биологични методи на изследване са разделени на три големи групи:

1. Амплификация (с използване на различни ензими). Това включва PCR - полимеразна верижна реакция, която играе голяма роля в много от диагностичните методи.

2. Неназование. Тази група методи е пряко свързана с работата на смеси от нуклеинови киселини. Примери са 3 вида блотинг, in situ хибридизация и др.

3. Методи, основаващи се на разпознаване на сигнал от сондова молекула, която се свързва със специфична ДНК или РНК сонда. Пример за това е хибридизационната система в разтвор на хибридна система за улавяне (hc2).

Ензими, които могат да се използват при молекулярни биологични методи

Много методи за молекулярна диагностика включват използването на широк спектър от ензими. По-долу са най-често използвани:

1. Restrictase - "разрязва" ДНК молекулата в необходимите части.

2. ДНК полимераза - синтезира двойно-верижна молекула дезоксирибонуклеинова киселина.

3. Обратна транскриптаза (ревертаза) - използвана за синтезиране на ДНК върху матрицата на РНК.

4. ДНК лигаза - отговорна за образуването на фосфодиестерни връзки между нуклеотидите.

5. Екзонуклеаза - премахва нуклеотидите от крайните секции на молекулата на дезоксирибонуклеиновата киселина.

PCR е основният начин за разширяване на ДНК

Полимеразната верижна реакция (PCR) се използва активно в съвременната молекулярна биология. Това е метод, при който огромен брой копия могат да бъдат получени от единична ДНК молекула (амплифициране на молекули).

Основните функции на PCR са:

- диагностика на заболявания;

- клониране на ДНК, гени.

За провеждане на полимеразна верижна реакция изисква следните елементи: първоначалното ДНК молекула, термостабилна ДНК полимераза (Taq или Pfu), деоксирибонуклеотидни фосфати (източници на азотни бази) праймерите (праймер 2 1 ДНК молекула) се буферната система, в които са възможни всички реакции.

PCR се състои от три етапа: денатурация, отгряване на праймери и удължаване.

1. Денатуриране. При температура от 94-95 градуса по Целзий продължава разпадането на водородните връзки между двата ДНК нишки и в резултат на това се получават две молекули с една верига.

2. Закаляване на праймерите. При температура от 50-60 градуса по Целзий, праймерите са прикрепени в краищата на молекулите на едноверижната нуклеинова киселина чрез вида на комплементарност.

3. Удължаване. При температура от 72 градуса се осъществява синтезата на дъщерни двойно-верижни молекули на дезоксирибонуклеиновата киселина.

ДНК секвениране

Молекулярните биологични методи често изискват познаване на последователността на нуклеотидите в молекулата на дезоксирибонуклеиновата киселина. За да се определи генетичен код се извършва секвениране. Молекулярната диагностика на бъдещето ще се основава на знанията, получени при определяне на последователността на дадено лице.

Различават се следните типове секвениране:

• секвениране от Maxam-Gilbert;
• последователност от Sanger;
• пиросеквениране;
• нанопоресто секвениране.