Молекулярна диагностика: PCR в реално време

Понастоящем е разработен механизъм за молекулярна диагностика полимеразна верижна реакция (PCR), което е стимул за развитието на голям брой методи за диагностика болести въз основа на определението за генетичен материал. За да се извърши PCR в реално време, генният фрагмент (по - специално нуклеинова киселина) причинителен агент на заболяването, което не се среща при други индивиди.

Принципът на PCR е размножаването на определен патоген ДНК фрагмент милиони пъти с ДНК полимераза в специално устройство, по-нататък термосайклера, което осигурява цикличен повторение на температурен режим за дадена програма.

Диагнозата на PCR дава възможност за повторение на серия от усилвания, като се запазва активността на ензима. Когато усилването преминава безпрепятствено, в един цикъл броят копия на определен район от патогенната ДНК се удвоява след тридесет цикъла - сто и десет пъти. Ето защо PCR се използва при диагностицирането за идентифициране на достатъчно малки патогени, чието откриване е невъзможно без това.

Трябва да се отбележи, че РНК не може да бъде матрица за PCR в реално време. Следователно, за да се открие вирусна РНК, е необходимо да се получи ДНК, съответстваща на неговия фрагмент, преди амплификация. Полимеразната верижна реакция прави възможно измерването на ДНК и РНК на патогена. Получената по този начин информация се използва за наблюдение на ефективността на използваната терапия, както и за оценка на клиничната прогноза.

В допълнение, в реално време PCR не изисква допълнителни действия по отношение на декриптиране на целевата ДНК или ампликоните, която служи като бариера за правилната диагноза и да доведе до неверни резултати. Този подход ни позволява да не използваме етапа на електрофореза, което води до намаляване на риска от инфекция с продукти на полимеразна верижна реакция. Също така, в резултат на намаляването на броя на манипулации с агент, намалява времето на изследването, то опростява процеса, намалява вероятността от грешки. PCR също ви позволява да определите началната брой копия на ДНК-то на патогена в клинично изпитване, за да ви помогне да идентифицирате периоди на обостряне и да се предприемат навременни мерки, за да се излекува пациента.

Към днешна дата има много методи за фиксиране на усилването в реално време. Най-често се използват различни техники за прилагане ампликон корелират с флуорогенни сонди, интензитет на излъчване на която варира в зависимост от натрупването на ампликон и записани в реално време с помощта на специално устройство, наречено термоциклер с оптичен модул. Това осигурява висока степен на чувствителност на анализа. В същото PCR продукт може да се открие, заедно с голямо количество странични продукти, по време, когато се използва това електрофореза в някои случаи не се забелязва.

При PCR се използват положителни, контролни и отрицателни проби в реално време. По този начин положителните и отрицателните проби по време на изследването се анализират като отделни проби, след това контролната проба се добавя към всяка от тези проби и преминава през всички етапи на анализа.

Към днешна дата има голям брой инструменти за полимеразна верижна реакция. Те включват Bio-Rad, Applied Biosystems, Cepheid или Roche. Всеки от тях има заслуги и недостатъци

Следва да се отбележи, че PCR е диагностичен метод, използван в големи научни, изследователски и диагностични центрове по света, тъй като дава възможност за незабавно интерпретиране на получените резултати.