Молекулярен генетичен метод на изследване

За изследване и идентифициране на варианти в структурата на ДНК се използва молекулярен генетичен метод. За всеки изследван регион на ДНК регионът е хромозома, ген или алел, методите са различни. В сърцето на всеки молекулярен генетичен метод се съдържа известна манипулация на РНК и ДНК. Всички тези методи са изключително сложни, без да могат да се провеждат лабораторни условия, а персоналът трябва да бъде висококвалифициран. Тази работа се извършва на няколко етапа.

етапи

Първо, трябва да се получат проби от РНК или ДНК. Тук молекулно генетичен метод може да се прилага на практика всеки материал: капка кръв, левкоцити, фибробласти култура, лигавица (остъргват), дори и космените фоликули, - ДНК могат да бъдат получени от всяка проба. Подходящ е за прилагане на всеки молекулярен генетичен метод и техните различни варианти и вече разпределената ДНК се съхранява дълго време при замразяване. Вторият етап е посветена на натрупването на желаните фрагменти (амплификация) на ДНК, тъй като тя гарантира, полимеразна верижна реакция ин витро (ин витро без участие на жив организъм). В резултат на това избраният ДНК фрагмент се умножава с тази верижна реакция и количеството ДНК се увеличава буквално милион пъти.

Третият етап от молекулярните генетични методи на изследване е ограничаването на умножената ДНК (това е фрагментация, разкъсване или рязане). Ограничението се извършва чрез полиакриламидна или агарозна гел електрофореза. Този молекулярен генетичен метод за изследване на ДНК позволява на всеки фрагмент да заема определена позиция в гела. След това гелът се обработва с етидиев бромид, който може да се свърже с ДНК, като се извършва ултравиолетово облъчване, след което е възможно да се наблюдават луминисцентните участъци. Молекулярните генетични методи за диагностициране са разнообразни и многобройни, но първите два етапа са типични за всички. Но за да се идентифицират фрагменти от ДНК, гелът може да бъде оцветен с много други съществуващи методи.

вид

Най-преките и широко разпространени методи за откриване на микобактерии включват описания по-горе молекулярно-генетичен метод за изследване на ДНК. Същността му се състои в разкриването в диагностичния материал на специфични фрагменти от веригата на ДНК патогени. Молекулярните генетични методи за диагностициране все още нямат по-ефективен начин за разпознаване на такова заболяване като туберкулозата. Прилагайки полимеразна верижна реакция (PCR), можете да сте сигурни, че оригиналната ДНК ще увеличи броя на копията в един милион пъти, т.е. ще се появи усилване, което ще позволи визуализиране на резултатите. Нивото на чувствителност тук е много високо - повече от деветдесет и пет процента, което е основното предимство на този метод.

Останалите молекулярни генетични методи за изследване са два пъти по-ефективни от копирането, тъй като в този случай редакционната проба показва специфична олигонуклеотидна последователност, увеличена със сто и шест пъти. Дори културната диагноза на туберкулозата на дихателните органи е много по-ниска в своята чувствителност. Ето защо съвременната медицина разчита на молекулярни генетични методи за диагностициране на туберкулозата. И описаният метод е особено ефективен при срещи с патогени с висока антигенна вариабилност, за да се определи коя по друг начин е много по-трудна - специална хранителни среди и дълго време на отглеждане. Биохимичните и молекулярни генетични методи дават напълно различни ефекти.

Диагностика на туберкулозата

Маршал PCR диагностика на туберкулоза най-често с помощта на тези ДНК последователности, които са специфични за всички четири типа на заболяването. За да се постигне тази цел често се използват праймери, които откриват последователност се елементи (IS-986, Е-6110), като тези елементи характеризират далекомигриращи видове Mycobacterium туберкулоза и винаги присъстват множество копия в генома. Също извличане на ДНК може да се извърши от чисти култури и клинични (храчки от пациенти) по всеки друг подходящ метод. Например, има метод Boom където лизисния буфер се използва въз основа на тиоцианат гуанидин и силициев диоксид като ДНК носител. Броят на пациентите, които се различават лошото бактериологично увеличава всяка година, и по тази причина в клиничната практика е установила съвсем различно ниво на организация: молекулно-генетичен метод за изследване на ДНК играе важна роля в диагнозата.

Трябва обаче да признаем, че не е без недостатъци. Използването на метода на PCR често води до огромно количество фалшиви положителни резултати, а грешката тук е не само технически грешки, но и особеностите на самия метод. Наред с други неща, използването на този метод за диагностика, за да се определи степента на жизнеспособност на идентифицираните микобактерии, е просто невъзможно. Но този недостатък не е най-важният. Молекулярните генетични методи за PCR диагностика водят до опасност от замърсяване на микобактериалната ДНК. Изискванията за сертифициране поради тази причина за PCR лабораториите са изключително строги, изискват присъствието на три изолирани помещения. Технологията за PCR е модерна и много сложна, използването й изисква подходящо оборудване и висококвалифициран персонал.

bacterioscopy

При установяване на диагнозата, резултатите от PCR теста задължително трябва да бъдат сравнени с останалите данни: клиничен преглед, рентгенография, микроскопия на смазване, сеитба и дори отговор на специфично лечение са много важни тук. В тази серия от изследвания PCR е само един от компонентите. Откриването на патогена в самото начало на диагнозата може да бъде най-простият и бърз метод - бактериологичен.

Тук използваме светлинен микроскоп (цвят Циол-Нилсен) и луминесцентно (флуорохромно оцветяване). Предимството на бактериоскопията е скоростта, с която се получават резултатите. Недостатък на това се счита за ограничените възможности поради ниската чувствителност. Обаче този метод се препоръчва от СЗО като най-икономичен и основен за идентифициране на пациентите с туберкулоза. Откриването на микобактерии чрез бактериологичен метод има стойността на прогнозата и се определя количествено бактериалното освобождаване. Молекулярните генетични методи за изучаване на туберкулозата са много по-уверени в това.

Културни изследвания

Най-доброто откриване на микобактерии се признава от проучванията на културата. Сеитбата на патологичния материал се извършва в яйчни среди: Мордовски, Фин II, Левенщайн-Йенсен и други подобни. Индикативна мярка за развитието на резистентност на микобактерии към лекарства и косвено доказателство за ефикасност е количеството микобактерии или техните колонии in vitro, ако се използва метод за изследване на културата. За да се увеличи процентът на разпределение на микобактериите, патологичният материал се засява в няколко среди.

Задоволявайки многобройните културни потребности, причинителят също е снабден с течни медии. В същото време се използват автоматизирани системи за отчитане на растежа на вида VANTES. Културите трябва да се инкубират до седем до осем седмици. По това време сеитбата с липса на растеж може да се счита за отрицателна. Най-ефективният начин за идентифициране на туберкулозата на микобактериите е биологични тестове: инфектират диагностичния материал на морските свинчета, които са изключително чувствителни към туберкулоза.

Няколко цифри

Най-интересната област на изследване, открита чрез PCR диагностика, е изследването на М. tuberculosis, латентна инфекция. Съвременната концепция за инфекция с туберкулоза предполага, че от сто души, които са в контакт с M. tuberculosis, деветдесет могат да бъдат заразени, но само 10 от тях имат активна болест. Останалите имат антитуберкулозен имунитет и следователно в деветдесет процента от случаите инфекцията ще остане латентна. Молекулярният генетичен метод е помогнал да се открие този модел.

Генетиците казват, че петдесет и пет процента от тези, чиито култури патологичен материал са отрицателни, и осемдесет процента от хората, заразени с М. туберкулоза, но не текат рентгенографски прояви на заболяване, PCR положителни отговори, получени. Това е генетично диагностичен метод помага за идентифициране на пациенти с риск от PCR изследвания, с резултатите от анализи (микроскопия и култура) бяха отрицателни, и субклинична инфекция с М. туберкулоза присъства.

Съвременни изследвания

Бактериологичните лаборатории на Руската федерация използват ускорен метод за абсолютна концентрация: активността на нитратната редуктаза на микобактериите се изследва с помощта на реагента на Griss. Центърът за борба с туберкулозата използва метод, който позволява да се определи лекарствената резистентност. Това е култура в течна среда, където е автоматизирана радиометрична и флуоресцентна система за регистриране на растежа на микобактерии. Такъв анализ се извършва бързо - до две седмици.

Понастоящем се разработват нови методи: лекарствена резистентност на микобактерии се измерва на ниво генотип. Проучването на молекулярните механизми на резистентност показва наличието на гени в микобактериите. Тези гени са свързани с резистентност към определени лекарства. Например, КАСА гени, Inha, katG устойчиви на изониазид, rpoB ген - рифампицин 16Sp РНК гени и rpsL - стрептомицин, emb1 - да етамбутол, GyrA - флуорохинолон и така нататък.

мутации

В съвременната диагностика молекулярното генетично ниво на ДНК метода се е увеличило значително и е било позволено да се извършват широкомащабни изследвания на мутации в целия им спектър. Сега знаем, че мутациите в 516, 526 и 531 кодона на rpoB гена са най-чести и е идентифицирана резистентност към различни лекарства. Има широк спектър от методи за типизиране на микобактерии, като се използват не само традиционните методи - биохимични, биологични и културни, но и широко се използват съвременни молекулярни генетични методи. Вече съществуват адекватни и надеждни диагностични методи за откриване на моногенни заболявания. Те се основават на ДНК изследвания в точния регион на определен ген. Това обикновено е сложен процес, отнемащ време и скъпо, но данните, предоставени от методите за молекулярен генетичен анализ, са много по-точни и информативни от данните от всички останали анализи.

Отдавна е известно, че ДНК не се променя за целия живот на организма, че е във всеки ядрени клетки odnakova, а това дава възможност да се вземат анализ на абсолютно всички клетки на тялото, на всеки етап от онтогенезата. Увредената ген може да се открие преди появата на първите симптоми на клиничното заболяване пълен мащаб, както и при здрави хетерозиготни хората, но с мутация в гена. Molecular диагностични методи генетично наследствено заболяване позволяват да се разкрие (директен подход, ДНК диагностика), както и да се анализира сегрегацията на заболяването в семейството с маркер локуси ДНК (генетични полиморфизми), които са тясно свързани с увреден ген (т.е., индиректен подход на ДНК диагностика). Пряка или непряка - всяка ДНК диагноза се основава на методи, които идентифицират строго дефинирана област на човешката ДНК.

Директни методи

Директните методи за диагностициране на ДНК се използват в случаите, когато е виден генният виновник на наследственото заболяване и са известни и видовете му мутации. Например, директните методи са подходящи за различни заболявания. Това е Хорея на Хънтингтън (експанзия на CTG повторения), фенилкетонурия (R408W), кистозна фиброза (delF508, основна мутация) и други подобни. Основното предимство на директния метод е сто процента точност на диагнозата и няма нужда да се прави ДНК анализ на останалата част от семейството. Ако се открие мутация в съответния ген, тя ви позволява точно да потвърдите диагнозата наследственост, да определите генотипа за останалата част от обремененото семейство.

Друго предимство на директната диагноза е откриването на хетерозиготен пренос на лоши мутации в роднини и родители на починалия от болестта. Това важи особено за болестите на автозомно рецесивно. Недостатъците на преките методи също са на разположение. За да ги приложите, трябва да знаете точно локализацията на патологичния ген, структурата на екзон-интрон и спектъра на неговите мутации. Не всички моногенни заболявания са получили такава информация днес. Информативността на преките методи не може да се счита за пълна, тъй като един и същи ген може да има голям брой патологични мутации, които определят развитието на наследствени заболявания.

Непреки методи

Индиректни методи в ДНК диагностика се използват изобщо, в други случаи, ако увредената ген не е определена, но само хромозомно, или диагноза на линията не дава резултат (това се случи, ако ген комплекс молекулно организацията или голяма степен, ако има много патологични мутации). Непреки методи се използват за анализиране на сегрегацията на полиморфните маркери в семейството на алелите. Маркери намерени в същия хромозомен регион или локус е тясно свързани с болестта и представляват делеции или инсерции, точка замествания, повторения и тяхното полиморфизъм се дължи на различно количество на клетките в блока.

Най-удобни за непряка диагностика са микросателитните и миниизателитните полиморфни маркери, които са широко разпространени в човешкия геном. Тяхната стойност се изразява в висока информативност, ако генетичното разстояние между увреждането в гена и маркера не е твърде голямо. В последния случай точността на оценката се определя до голяма степен от честотата на рекомбинация между полиморфния маркер и лезията. Индиректни диагностични методи също осигуряват задължително предварителна стъпка на алелните честоти на анализирания изследването население сред пациенти и носители на мутации, както и необходимостта от определяне на вероятността от рекомбинация на nonequilibrium и адхезионни маркери и мутантни алели.

Други методи

Кратките сегменти на РНК или ДНК, както и един ген, не могат да бъдат визуализирани чрез микроскопско изследване, поради което да се идентифицират мутации, са необходими методи за молекулярна генетична диагностика. Съществуващият "Проект на човешки геном", подобно на други постижения в молекулярната генетика, в много отношения разшири възможността за диагностициране на наследствени заболявания - както преди, така и постнатално. Тези методи могат да осигурят ранно откриване и да направят предсказване на поли- и моногенни заболявания, при които дебютът се случва в зряла възраст. За съжаление, по отношение на техническите възможности, молекулярните генетични изследвания понякога надхвърлят етичните рамки, които са установени по отношение на наследствеността, особено когато диагнозата се провежда в юношеството и детството.

Структурните и количествените аномалии на хромозомите са най-честите причини както за онкологичните заболявания, така и за много аномалии в развитието. Необходимо е да се идентифицират хромозомни аберации, което е важно за семейно консултиране - да се прецени прогнозата заедно с репродуктивния риск при бъдещи бременности. Хромозомният анализ е "златният стандарт" на генетичната диагностика, но има и ограничени възможности. Само методи молекулярен генетичен анализ могат да направят повече, защото използват флуоресцентни етикети, базирани на технологии за клониране, са в състояние да открият с висока чувствителност силни хромозомни промени, които не могат да бъдат открити от класическите цитогенетични изследвания. Тези техники разширяват все повече нашите диагностични възможности, когато се изследват деца с дефекти в развитието, с умствена изостаналост и много други наследствени заболявания.

данни

Това е много важно за човечеството бяха генна структура и функцията на знания, видове променливост, способността за откриване на наследствени заболявания, които се появяват във връзка с развитието на молекулярната генетика. Неговите методи са насочени към изучаване на ДНК молекулата - и когато тя е нормална и ако тя е повредена. Приготвянето на нуклеотидни последователности на дезоксирибонуклеинова киселина (ДНК) преминава стъпка по стъпка от приготвянето на пробите до идентифицирането на отделните фрагменти. Изолиране на геномна ДНК от клетките, ограничение (разкъсване), амплификация (клониране), електрофореза на фрагментите (отделяне им електрически заряд и молекулно тегло от агарозен гел). Идентифициране на някои фрагменти, разположени на повърхността му от дискретна лента.

След получаване на акт специални филтри, през които преминава всеки фрагмент хибридизация с клонирани ДНК фрагменти или синтетични радиоактивни сонди е контрола, която ще бъде равна на всяка проба. Ако промените позицията или дължина в сравнение с пробата, ако нов фрагмент или изчезнали - всичко това предполага, че анализирани гена е претърпял преструктуриране на нуклеотидната последователност. Има осем основни техники на молекулярно-генетични изследвания: секвениране (определяне на ДНК последователност), полимеразна верижна реакция (увеличаване на броя на последователности), получаването на праймери известни гени, ДНК клониране, за производство на рекомбинантни молекули получени протеини поради рекомбинантни молекули, създаване на пълен набор (събиране библиотека) от клонирани фрагменти, които са получени чрез ограничаване.